Флуоресцентная микроскопия широко используется в биохимии и науках о жизни, т.к. она позволяет ученым непосредственно наблюдать клетки и определенные соединения внутри и вокруг них. Флуоресцентные молекулы поглощают свет в определенном диапазоне длин волн, а затем повторно излучают его в более длинном диапазоне длин волн. Однако основным ограничением традиционных методов флуоресцентной микроскопии является то, что результаты очень трудно оценить количественно; На интенсивность флуоресценции существенно влияют как условия эксперимента, так и концентрация флуоресцентного вещества. Теперь новое исследование ученых из Японии должно произвести революцию в области микроскопии времени жизни флуоресценции. Читайте дальше, чтобы понять, как это сделать!
Способ решения традиционной проблемы состоит в том, чтобы сосредоточиться на продолжительности флуоресценции, а не на интенсивности. Когда флуоресцентное вещество облучается короткой вспышкой света, результирующая флуоресценция не исчезает сразу, а фактически “затухает” со временем, специфичным для этого вещества. Метод «микроскопии времени жизни флуоресценции» использует это явление – которое не зависит от условий эксперимента – для точной количественной оценки флуоресцентных молекул и изменений в их среде. Однако затухание флуоресценции происходит очень быстро, и обычные камеры не могут его зафиксировать. Хотя вместо этого можно использовать одноточечный фотодетектор, его необходимо сканировать по всей области образца, чтобы можно было восстановить полное 2D-изображение из каждой измеренной точки. Этот процесс включает в себя движение механических частей, что значительно ограничивает скорость захвата изображения.
К счастью, в этом недавнем исследовании, опубликованном в Достижения науки, вышеупомянутая группа ученых разработала новый подход к получению изображений времени жизни флуоресценции без необходимости механического сканирования. Профессор Такеши Ясуи из Института пост-светодиодной фотоники (pLED) Университета Токусима, Япония, который руководил исследованием, объясняет: «Наш метод можно интерпретировать как одновременное отображение 44 400 световых секундомеров в двумерном пространстве для измерения времени жизни флуоресценции. – все одним снимком и без сканирования ». Итак, как этого добиться?
Одним из основных принципов их метода является использование гребенки оптических частот в качестве возбуждающего света для образца. Гребенка оптических частот – это, по сути, световой сигнал, состоящий из суммы множества дискретных оптических частот с постоянным интервалом между ними. Слово «гребешок» в этом контексте относится к тому, как сигнал выглядит в зависимости от оптической частоты: плотный кластер эквидистантных «шипов», поднимающихся от оси оптических частот и напоминающих гребень для волос. Используя специальное оптическое оборудование, пара сигналов гребенки частоты возбуждения разлагается на отдельные оптические сигналы биений (оптические биения двойной гребенки) с разными частотами модуляции интенсивности, каждый из которых несет одну частоту модуляции, и облучается на целевой образец. Ключевым моментом здесь является то, что каждый световой луч попадает на образец в пространственно отличном месте, создавая взаимно однозначное соответствие между каждой точкой на двумерной поверхности образца (пикселя) и каждой частотой модуляции оптических биений двойной гребенки.
Благодаря своим флуоресцентным свойствам образец повторно излучает часть захваченного излучения, сохраняя при этом вышеупомянутое соответствие положения и частоты. Затем флуоресценция, испускаемая образцом, просто фокусируется с помощью линзы на высокоскоростной одноточечный фотодетектор. Наконец, измеренный сигнал математически преобразуется в частотную область, и время жизни флуоресценции в каждом «пикселе» легко вычисляется из относительной фазовой задержки, которая существует между сигналом возбуждения на этой частоте модуляции по сравнению с измеренным.
Благодаря своей превосходной скорости и высокому пространственному разрешению метод микроскопии, разработанный в этом исследовании, упростит использование преимуществ измерения времени жизни флуоресценции. «Поскольку наша техника не требует сканирования, одновременное измерение всего образца гарантируется в каждом снимке, – отмечает профессор Ясуи. – Это будет полезно в науках о жизни, где необходимы динамические наблюдения за живыми клетками». Помимо обеспечения более глубокого понимания биологических процессов, этот новый подход можно использовать для одновременной визуализации нескольких образцов для тестирования антигена, который уже используется для диагностики COVID-19.
Возможно, наиболее важным является то, что это исследование демонстрирует, как оптические частотные гребенки, которые использовались только в качестве «частотных линейок», могут найти место в методах микроскопии, чтобы расширить границы в науках о жизни. Это многообещающе для разработки новых терапевтических возможностей для лечения трудноизлечимых заболеваний и увеличения продолжительности жизни, что принесет пользу всему человечеству.