Новый, чувствительный и надежный метод секвенирования одноклеточной РНК превосходит конкурентов

Появление секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) произвело революцию в области медицины и биологии, предоставив возможность изучать внутреннюю работу тысяч клеток за один раз. Но методы scRNA-seq ограничены потенциальными неточностями в определении состава клеток и неэффективной амплификации комплементарной ДНК (кДНК) — процесса, при котором двухцепочечная ДНК, «дополняющая» одноцепочечную РНК, генерируется и реплицируется миллионы раз. — с помощью широко используемой реакции переключения шаблона.


Недавно исследовательская группа из Японии под руководством ассистента профессора Шигеюки Шичино и профессора Кодзи Мацусима из Токийского научного университета разработала новый и улучшенный метод секРНК-секвенирования. В новом методе твердофазной амплификации и секвенирования кДНК с помощью терминатора (TAS-Seq) используются простые материалы и оборудование для получения более точных данных scRNA-seq, чем в современных широко используемых технологиях. «Наш метод, TAS-Seq, сочетает в себе ость генетического обнаружения, надежность эффективности реакции и точность клеточного состава, что позволяет нам получать важную клеточную информацию», — рассказывает ассистент профессора Шичино. Исследование было опубликовано в журнале Communications Biology 27 июня 2022 года. В исследовательскую группу также входили доцент Сатоси Уэха из Токийского научного университета, профессор Така-аки Сато из Университета Цукуба и профессор Шиничи Хасимото из Медицинского университета Вакаяма.

TAS-Seq использует независимый от матрицы фермент для амплификации кДНК, называемый терминальной трансферазой (TdT). Но с TdT трудно справиться. Чтобы преодолеть эту проблему, исследовательская группа включила дидезоксинуклеотидфосфат (ddNTP) в качестве «терминатора» для реакции амплификации кДНК. «Добавление ddNTP, в частности дидезоксицитидинфосфата (ddCTP), стохастическим образом останавливает чрезмерное удлинение полиN-хвоста TdT и значительно снижает технические трудности реакции TdT», — объясняет ассистент профессора Шичино. TAS-Seq также использует платформу scRNA-seq на основе нанолунок/шариков, которая позволяет изолировать отдельные клетки в образцах тканей, тем самым снижая погрешность выборки клеток и повышая точность данных о составе клеток. Затем исследовательская группа проверила эффективность TAS-Seq и сравнила ее с текущими, широко используемыми методами секРНК-секвенирования, 10X Chromium V2 и Smart-seq2, используя образцы легочной ткани мыши и человека. Они обнаружили, что TAS-Seq может не только обнаруживать больше генов в целом, но и идентифицировать более вариабельные гены по сравнению с основными платформами scRNA-seq. Ассистент профессора Шичино говорит: «Мы обнаружили, что TAS-Seq может преить 10X Chromium V2 и Smart-seq2 с точки зрения чувствительности обнаружения генов и частоты выпадения генов, что указывает на то, что TAS-Seq может быть одним из наиболее чувствительных высокопроизводительных тестов. методы scRNA. Мы можем более равномерно обнаруживать гены в широком диапазоне уровней экспрессии, а также более надежно обнаруживать гены факторов роста и интерлейкинов».

Дополнительным преимуществом нового метода является то, что TAS-Seq менее чувствителен к эффектам партии. Данные TAS-Seq также в высокой степени коррелировали с данными проточной цитометрии образцов тканей, что указывает на возможность получения высокоточных данных о составе клеток.

Говоря о будущем, ассистент профессора Шичино рассказывает: «Мы уже завершенный разработка TAS-Seq2, улучшенной, значительно оптимизированной версии TAS-Seq. TAS-Seq2 в 1,5-2 раза более чувствителен к обнаружению генов в клетках селезенки мыши.Исследовательская группа также учредила ImmunoGenetics, венчурную компанию Токийского научного университета, для предоставления услуг scRNA-seq с использованием TAS-Seq и TAS-Seq2.

scRNA-seq — важный инструмент для исследователей в области медицины и биологии. Разработка TAS-Seq и TAS-Seq2 приведет к открытию новых терапевтических мишеней для заболеваний и достижениям в области «пространственной транскриптомики», которая также опирается на твердофазный синтез кДНК. Это также ускорит разработку технологии одноклеточных омиксов, тем самым способствуя нашему пониманию принципов биологии и развития и прогрессирования заболеваний.

Видео: https://youtu.be/B803lwsiu9w