Новый супрамолекулярный носитель CRISPR-Cas9 обеспечивает более эффективное редактирование генома

Сгруппированные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы (CRISPR) и сопутствующий им белок, CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9), несколько лет назад попали в заголовки международных газет как революционная система редактирования генома. Состоящая из Cas9 и нити генетического материала, известной как РНК с одним проводником (sgRNA), система может нацеливаться на определенные области ДНК и функционировать как «молекулярные ножницы» для точного редактирования. Прямая доставка комплексов Cas9-sgRNA, т.е. рибонуклеопротеинов Cas9 (RNPs), в ядро ​​клетки считается наиболее безопасным и эффективным способом редактирования генома. Однако Cas9 RNP имеет плохую клеточную проницаемость и, таким образом, требует молекулы-носителя для его транспортировки через первое препятствие клеточной мембраны, прежде чем он сможет добраться до клеточного ядра. Эти носители должны связываться с RNP Cas9, переносить его в клетку, предотвращать его деградацию внутриклеточными органеллами, называемыми «эндосомами», и, наконец, высвобождать его, не вызывая каких-либо изменений в его структуре.


В недавней статье, опубликованной в июне 2022 г. в томе 27 Прикладные материалы сегодня, исследовательская группа из Университета Кумамото разработала трансформируемый полиротаксановый (PRX) носитель, который может облегчить редактирование генома с использованием Cas9RNP с высокой эффективностью и удобством использования. «Несмотря на то, что ранее сообщалось о некоторых носителях лекарств на основе PRX для нуклеиновых кислот и белков, это первое сообщение о носителе RNP Cas9 на основе PRX. Кроме того, наши результаты описывают, как точно контролировать внутриклеточную динамику на нескольких этапах. бесценно для будущих исследований в этом направлении», — говорит профессор Кейити Мотояма, автор статьи.

Для своего нового носителя исследовательская группа сосредоточилась на PRX с аминогруппами, то есть на амино-PRX, и прошла несколько этапов разработки и оптимизации, прежде чем получить конечный продукт. Например, первое поколение (1G) их молекул-носителей использовало автономные трансформирующие свойства амино-PRX, чтобы эффективно связывать его с RNP Cas9 и обеспечивать его доставку через клеточную мембрану. Второе поколение (2G) работало в направлении побега эндосом. Это было достигнуто за счет превращения аминогрупп в амино-PRX в высококатионные (положительно заряженные) частицы внутри эндосомы, что привело к разрыву эндосомы и выходу Cas9 RNP-amino-PRX. Следующие несколько поколений решали проблемы, связанные с высвобождением Cas9 после выхода комплекса из эндосомы. Наконец, они разработали многоступенчатый трансформируемый переносчик амино-PRX пятого поколения (5G), который мог точно и эффективно доставлять Cas9 RNP в ядро ​​клетки. Исследовательская группа также провела эксперименты in vitro и in vivo, чтобы подтвердить цитотоксичность системы, а также эффективность ее редактирования генома. «Наша система доставки обладает низкой цитотоксичностью, а ее активность по редактированию генома равна самой эффективной системе на рынке в настоящее время», — рассказывает доцент Тайши Хигаси из Университета Кумамото, который является другим автором исследования. «Более того, наши многочисленные попытки оптимизировать систему доставки для разных поколений дают важную информацию о типах и положениях различных биоразлагаемых групп и аминогрупп, которые можно использовать в такой системе для дальнейшей настройки и адаптации их свойств».

Автономное действие, свойства многоступенчатой ​​трансформации и низкая цитотоксичность носителя 5G-амино-PRX делают его чрезвычайно многообещающим кандидатом для безопасной и эффективной доставки RNP Cas9. Кроме того, эти результаты могут быть применены для доставки широкого спектра молекул, таких как ферменты, антитела и малые интерферирующие РНК (миРНК), что делает этот новый носитель значительным достижением в области разработки лекарств и вакцин.